質(zhì)粒DNA實驗步驟：
一、搖菌培養(yǎng)
1. 將鑒定測序正確的克隆菌液涂在LB固體平板。
2. 置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12-17h，待長出菌落。
3. 滅菌15ml離心管內(nèi)加入5ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，編號標記。
4. 挑取單克隆菌團放置液體培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基放置1個菌落。
5. 37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)過夜。
二、質(zhì)粒DNA的純化
1. 將之前提取好的質(zhì)粒放入1.5ml離心管中，加入1/10體積的3mol/L 無菌乙酸鈉溶液。
2. 加入2倍體積的無水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或過夜。
3. 4℃，高速離心機14000rpm，離心20min。
4. 棄去上清，70%乙醇洗2次。
5. 空氣干燥，可置超凈工作臺干燥。
6. 加200ul無菌水溶液干燥后所得沉淀，即為質(zhì)粒溶液。
7. 紫外分光光度計測量質(zhì)粒濃度和產(chǎn)量。測量OD260和OD280的值：質(zhì)粒DNA濃度=OD260×50×稀釋倍數(shù)(μg/mL)。
三、質(zhì)粒DNA提取常見問題
1. 時間控制問題裂解時間太長，加入溶液P2后裂解時間不應(yīng)超過5 分鐘；吸附時間不夠；溶解時間不夠都會導致質(zhì)粒DNA提取實驗失敗。
2. 大腸桿菌老化建議涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng)。
3. 質(zhì)粒拷貝數(shù)低由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA 提取量低，可更換具體相同功能的高拷貝數(shù)載體。
4. 溶液使用不當溶液P2、P3 在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。
5. 吸附柱過載不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB 或者 ×YT 菌液體積必須減少；若質(zhì)粒或宿主菌是非常高的拷貝數(shù)或生長率，則需調(diào)整LB 培養(yǎng)液體積。
6. 質(zhì)粒未全部溶解洗脫溶解質(zhì)粒時，可適當加溫或延長溶解時間。
7. 乙醇殘留漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。
8. 洗脫液加入位置不正確洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會覆蓋硅膠膜的表面達到洗脫效率。
9. 洗脫液不合適DNA 只在低鹽溶液中才能被洗脫。洗脫效率取決于pH 值。洗脫效率在pH7.0～ 8.5 間。當用水洗脫時確保其 pH 值在此范圍內(nèi)，如果pH 過低可能性導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加暖至 60 ℃后使用有利于提高洗脫效率。
10. 洗脫體積太小洗脫體積對來回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
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